Rediģēja Pīters Sarnovs, Stenfordas Universitātes Medicīnas skola, Stenfordas Universitāte, Kalifornija, apstiprināts 2020. gada 25. decembrī (pārskatīts 2020. gada 25. oktobrī)
Mēs ziņojam par mijiedarbību starp apakšvienībām koronavīrusu-transkripcijas kompleksu replikācijā, kas ir būtiski replikācijai un evolūcijas saglabāšanai.Mēs sniedzām pierādījumus tam, ka NiRAN domēnam, kas saistīts ar nsp12, ir nukleozīdu monofosfāta (NMP) transferāzes aktivitāte trans, un kā mērķi identificējām nsp9 (RNS saistošu proteīnu).NiRAN katalizē NMP daļas kovalento piesaisti konservētajam nsp9 aminogalam reakcijā, kas balstās uz Mn2+ joniem un blakus esošajiem konservētajiem Asn atlikumiem.Tika konstatēts, ka NiRAN aktivitāte un nsp9 NMPilācija ir būtiska koronavīrusa replikācijai.Dati ļauj saistīt šo ligzdotā vīrusa enzīma marķiera aktivitāti ar iepriekšējiem novērojumiem hipotēzē, ka RNS sintēzes uzsākšana RNS vīrusu klasē ir funkcionāli un evolucionāri konsekventa.
RNS atkarīgā Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae un 12 citu ģimeņu) RNS polimerāze (RdRps) ir saistīta ar aminotermināla (N-termināla) domēnu nestrukturālajā proteīnā (nsp), kas atbrīvots no poliproteīna, ko sauc par NiRAN. 1ab sastāv no vīrusa galvenās proteāzes (Mpro).Iepriekš tika ziņots par arteriālā vīrusa NiRAN-RdRp nsp paša GMPilācijas/UMPilācijas aktivitāti, un tika ierosināts radīt īslaicīgu nukleozīdu monofosfāta (NMP) pārnešanu uz (šobrīd nezināmu) vīrusu un/vai šūnu biopolimerizācijas lietām.Šeit mēs parādām, ka koronavīrusam (cilvēka koronavīruss [HCoV]-229E un smaga akūta respiratorā sindroma koronavīruss 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ir no Mn2+ atkarīga NMPilācijas aktivitāte, kas tiek iegūta no nsp9, veidojot Mpro mediētu nsp9. N-gala blakus esošais nsps tiek proteolītiski atbrīvots, fosforamidāts ir saistīts ar primāro amīnu (N3825) nsp9 N-galā.Šajā reakcijā vēlamais nukleotīds ir uridīna trifosfāts, taču piemēroti līdzsubstrāti ir arī adenozīna trifosfāts, guanozīna trifosfāts un citidīna trifosfāts.Mutāciju pētījumi, izmantojot rekombinantos koronavīrusa nsp9 un nsp12 proteīnus un ģenētiski modificētos HCoV-229E mutantus, noteica atlikumus, kas nepieciešami NiRAN mediētajai nsp9 NMPilācijai un vīrusa replikācijai šūnu kultūrā.Dati apstiprināja NiRAN aktīvās vietas atlieku prognozi un noteica nsp9 N3826 atlieku svarīgo lomu nsp9 NMPilācijā un vīrusa replikācijā in vitro.Šis atlikums ir daļa no konservētās N-gala NNE tripeptīdu sekvences un izrādījās vienīgais nemainīgais nsp9 un tā homologu atlikums koronavīrusu ģimenē.Šis pētījums nodrošina stabilu pamatu citu ligzdotu vīrusu NMPilācijas aktivitātes funkcionālajam pētījumam un ierosina iespējamos mērķus pretvīrusu zāļu izstrādei.
Nidovirales pozitīvās virknes RNS vīruss inficē dažādus mugurkaulniekus un bezmugurkaulniekus (1, 2).Šobrīd pasūtījumā ir iekļautas 14 ģimenes (3), no kurām koronavīrusu saime ir plaši pētīta pēdējo 20 gadu laikā.Tolaik no dzīvnieku saimniekiem izcēlās trīs zoonozes koronavīrusi, kas izraisīja plaša mēroga smagu elpceļu infekciju uzliesmojumus cilvēkiem.Tostarp ilgstošas pandēmijas, ko izraisa smagas akūtas infekcijas slimības.Elpošanas sindroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovīrusiem ir kopīga genoma organizācija, un ar membrānu saistītā replikācijas-transkripcijas kompleksa (RTC) apakšvienība ir kodēta 5-β²-gala divās trešdaļās un vīrusa daļiņas galvenajā strukturālajā apakšvienībā, kā arī daži piederumi. .Proteīns, kodē genoma 3??² beigu trešdaļā (1).Izņemot vienu planāru vīrusu (Monoviridae) saimi (8), visi ligzdotie vīrusi kodē RTC apakšvienības divos lielos atvērtos lasīšanas rāmjos (ORF) ORF1a un ORF1b, kas tiek tulkoti no genoma RNS.ORF1a kodē poliproteīnu (pp) 1a, un ORF1a un ORF1b kopīgi kodē pp1ab.Vispārīgi piedaloties galvenajai proteāzei (Mpro), ko kodē ORF1a, gan pp1a, gan pp1ab tiek proteolītiski pārstrādāti dažādos nestrukturālos proteīnos (nsps), kas pazīstami arī kā 3CLpro, jo tam ir homoloģija ar pikornavīrusa 3Cpro ( 9).Tiek uzskatīts, ka šie nsps ir apvienoti lielā dinamiskā RTC, katalizē genoma RNS sintēzi (replikāciju) un subgenomisko RNS kopu (transkripciju) un tiek izmantoti, lai koordinētu ORF ekspresiju, kas atrodas lejpus ORF1b (10? ?12).
RTC kodols ietver no RNS atkarīgo RNS polimerāzi (RdRp) (13), 1. virsģimenes helikāzi (HEL1) (14, 15) un vairākus RNS apstrādes enzīmus, kas galvenokārt ir kodēti ORF1b un koronavīrusu saimē Tas satur nsp12-nsp16 un nsp9-nsp12 Arterioviridae ģimenē (skatīt atsauci 10ââ 12).RdRp un HEL1 ir divi (viena piektā daļa) konservēti putna ligzdas vīrusa domēni, un tiem ir homoloģija starp citiem RNS vīrusiem.Tiek uzskatīts, ka kodola replikāciju palīdz citas apakšvienības, tostarp vairākas mazas nsp, kas atbrīvotas no pp1a karboksi-termināla (C-termināla) reģiona, lejpus Mpro (attiecīgi koronavīrusa nsp5 un arteriālā vīrusa nsp4).Viņiem ir ierobežota ģimenei specifiska aizsardzība un dažādas aktivitātes (pārskatītas atsaucē 10âââ12).
Salīdzinoši nesen visos ligzdotajos vīrusos aminogalā (N-galā), kas atrodas blakus RdRp, tika atrasts domēns ar unikālām sekvences motīva īpašībām, bet ne citiem RNS vīrusiem (16).Pamatojoties uz tā atrašanās vietu un nukleotīdu transferāzes (nukleozīdu monofosfāta [NMP] transferāzes) aktivitāti, šis domēns tiek nosaukts par NiRAN (ar Nestvirus RdRp saistītā nukleotīdu transferāze).NiRAN-RdRp divu domēnu kombinācija veido nsp12 Coronaviridae ģimenē un nsp9 Arterioviridae ģimenē, un sagaidāms, ka citos nestoviridae NiRAN-RdRp izdalīsies kā neatkarīgs nsp no vīrusa poliproteīna.Koronavīrusa gadījumā NiRAN domēns satur 1/450 atlikumus un ir savienots ar C-termināla RdRp domēnu caur linkera reģionu (16?19).Zirgu arterīta vīrusa (EAV) (Arteriviridae) gadījumā rekombinantais nsp9 uzrāda no Mn2+ jonu atkarīgas (paš) UMPilācijas un GMPilācijas aktivitātes, kas ir atkarīgas no trim konservētām sekvences bāzēm nestovīrusā, AN, BN un CN. Atlikumi secībā.Kur N apzīmē NiRAN) (16).Šo motīvu N-gala blakus ir mazāk konservatīvs motīvs preAN.Daži no šiem atlikumiem ir arī konservēti tālu radniecīgās proteīnkināzēs, kur ir pierādīts, ka tās ir iesaistītas nukleozīdu trifosfāta (NTP) saistīšanā un katalītiskajā aktivitātē (20, 21).Saskaņā ar šo novērojumu vairākas galvenās aktīvās vietas atliekas pseidokināzes SelO no Pseudomonas syringae var apvienot ar nesen publicēto SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleksu.Konservēti koronavīrusa NiRAN atlikumi, kas atrodas elektronu mikrostruktūrā.Rekombinantais proteīns (17).Tiek spekulēts, ka dokumentētā (paš) U/GMPilācija radīs pārejošu stāvokli, lai pārnestu NMP uz (šobrīd nezināmu) substrātu (16), un NiRAN un proteīnkināzes strukturālā līdzība (17, 19) ) Vai hipotēze NiRAN modificē citus proteīnus.
Daudzas funkcijas, tostarp tā unikālā un unikālā sistemātiskā saistība ar ligzdotajiem vīrusiem un ģenētiskā atdalīšana no RdRp, padara NiRAN par saprātīgu galveno regulējošo enzīmu ligzdotiem vīrusiem, kas ir būtiski to rašanās un identitātes nodrošināšanai.Iepriekš tika izsauktas trīs iespējamās funkcijas, kas saistītas ar NiRAN, lai regulētu genoma / subgenomisko translāciju vai replikāciju / transkripciju.Ņemot vērā tobrīd pieejamos ierobežotos un nepilnīgos datus, katrai funkcijai ir savas priekšrocības un trūkumi (16).Šajā pētījumā mūsu mērķis ir apvienot abas ģintis pārstāvošo koronavīrusu bioķīmiskos un reversos ģenētiskos pētījumus un savus atklājumus ievietot koronavīrusu ģimenes dabiskās mutācijas evolūcijas fonā, lai gūtu ieskatu šajā noslēpumainajā valstībā.Mēs ziņojam par lieliem sasniegumiem NiRAN izpratnē, identificējot dabiskos mērķus RTC, kas (starp trim pieejamajām hipotēzēm) veicina šī domēna lomu ligzdotā vīrusa RNS sintēzes uzsākšanā.Šis pētījums paver iespējas arī citām NiRAN lomām vīrusu saimniekdatora saskarnē.
Lai raksturotu ar koronavīrusu nsp12 saistītā NiRAN domēna fermentatīvās īpašības, mēs izveidojām cilvēka koronavīrusa 229E (HCoV-229E) nsp12 rekombinanto formu E. coli ar His6 tagu C-galā un apvienojām proteīns ar [α32-P ] Inkubējiet kopā ar NTP MnCl2 klātbūtnē, kā aprakstīts sadaļā Materiāli un metodes.Reakcijas produkta analīze liecināja par radioaktīvi iezīmēta proteīna klātbūtni, kas vienlaikus migrē ar nsp12 (106 kDa), norādot, ka koronavīruss nsp12 katalizē kovalento proteīna-NMP adduktu veidošanos, kas galvenokārt veidojas ar uridīna monofosfātu (UMP) (1.A attēls). B).Kvantitatīvā analīze parādīja, ka, salīdzinot ar citiem nukleotīdiem, UMP iekļaušanas signāla intensitāte palielinājās 2 līdz 3 reizes (1.C attēls).Šie dati saskan ar prognozēto koronavīrusa NiRAN domēna NMP transferāzes aktivitāti (16), taču norāda, ka koronavīrusa un arteriālā vīrusa NiRAN domēna nukleotīdu preferences atšķiras.
HCoV-229E nsp12 paš-NMPilācijas aktivitāte.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) tika inkubēts ar norādīto [α-32P] NTP 6 mM MnCl2 klātbūtnē 30 minūtes (sīkāku informāciju skatiet sadaļā Materiāli un metodes).Reakcijas produkti tika atdalīti ar SDS-PAGE un krāsoti ar Coomassie izcili zilu.(B) Radioaktīvi iezīmētais proteīns tiek vizualizēts ar fosfora attēlveidošanu.Nsp12-His6 un proteīna molekulmasas marķieru pozīcijas (kilodaltonos) ir parādītas A un B. (C) Radioaktīvā signāla intensitāte (vidējais ± SEM) tika noteikta trīs neatkarīgi eksperimentos.*P≤0,05.Signāla stiprums (procentos) ir saistīts ar UTP.
Lai gan ir pierādīts, ka ar NiRAN saistītās enzīmu aktivitātes ir būtiskas EAV un SARS-CoV replikācijai šūnu kultūrā (16), specifiskā NiRAN funkcija un iespējamie mērķi vēl nav noteikti.Nesen ziņotā strukturālā līdzība starp NiRAN un proteīnu ģimeni ar proteīnu kināzei līdzīgām krokām (17, 22) lika mums pārbaudīt hipotēzi, ka NiRAN katalizē citu proteīnu NMPilāciju.Mēs izveidojām potenciālu homologu mērķu kopu, tostarp nestrukturālus proteīnus, ko kodē HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), un katrs satur C-termināla His6 tagu (SI pielikums, S1 tabula) un inkubējiet šos proteīnus ar [α32-P] uridīna trifosfātu ([α32-P]UTP) nsp12 klātbūtnē vai bez tās.Liellopu seruma albumīns un MBP-LacZα saplūsmes proteīns, kas ražots E. coli, kalpoja par kontroli (2.A attēls, 1. līdz 7. josla).Radioaktīvi iezīmētais proteīns tika analizēts ar nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE) un autoradiogrāfiju, un tika konstatēts, ka reakcijā, kas satur nsp12 un nsp9, bija spēcīgs radioaktīvs signāls.Signāla pozīcija atbilst nsp9 molekulmasai, kas norāda uz nsp12 mediētu nsp9 UMPilāciju (2.B attēls, 7. celiņš).Netika konstatēts, ka citi testa proteīni būtu UMPylēti, kas lika mums secināt, ka nsp9 ir specifisks nsp12 substrāts.Saskaņā ar paš-NMPilācijas datiem, kas parādīti 1. attēlā, nsp12 spēj pārnest visus četrus NMP uz nsp9, lai gan efektivitāte ir atšķirīga, UMP> adenozīna monofosfāts (AMP)> guanozīna monofosfāts (GMP)> citidīna monofosfāts (CMP)) ( Bilde).3 A un B).Šajā testā izmantotajos apstākļos (saīsiniet reakcijas un ekspozīcijas laiku, samaziniet nsp12 koncentrāciju; materiāli un metodes), nsp12 paš-NMPilāciju nevarēja noteikt (sal. 2.B attēlu, 7. joslu un 1B attēlu), kas izrādījās efektīvs (un vairākas kārtas) UMP pārvietots no nsp12 uz nsp9.Lai nodrošinātu UMP transferāzes aktivitāti, ir nepieciešama Mn2+ jonu klātbūtne, kā parādīts 3.C attēlā, savukārt Mg2+ klātbūtnē tika novērota tikai minimāla UMP transferāzes aktivitāte, bet pārējo divu pārbaudīto divvērtīgo katjonu klātbūtnē – nekādas aktivitātes.Līdzīgi dati tika iegūti NMPilācijas testos, kas satur citidīna trifosfātu (CTP), guanozīna trifosfātu (GTP) un adenozīna trifosfātu (ATP) (SI pielikums, S1 attēls).
HCoV-229E nsp12 mediēta nsp9 UMPilācija.Lai novērtētu HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediētās HCoV-229E nsp12-His6⁺ UMPilācijas aktivitāti, tika izmantota virkne olbaltumvielu substrātu (tostarp liellopu seruma albumīns, MBP-lacZα un virkne HCoV-229E nsps, kas marķētas ar C-gala His6, ko kodē ORF1a). olbaltumvielas.Inkubējiet proteīnu ar [α-32P] UTP 10 minūtes bez nsp12 (A) vai klātbūtnes (B), kā aprakstīts materiālos un metodēs.A un B augšpusē ir parādīts SDS-poliakrilamīda gēls, kas iekrāsots ar Coomassie Brilliant Blue, un A un B apakšā ir parādītas atbilstošās autoradiogrammas.Kreisajā pusē ir norādīta proteīna molekulmasas marķiera pozīcija (kilodaltonos).Ir norādīta arī nsp12-His6 pozīcija (B, augšā) un radioaktīvais signāls, kas novērots nsp12-His6 inkubācijas laikā ar nsp9-His6 (B, 7. josla), kas norāda, ka [α-32P]UMP uz nsp9-His6 (12,9 kDa), kas netika novērots citiem pārbaudītajiem proteīniem.
HCoV-229E NiRAN mediēts nsp9 NMPilācijas bioķīmiskais un virusoloģiskais raksturojums.(A un B) Reakcijā izmantotā nukleotīda kopsubstrāta loma.Nsp12-His6 un nsp9-His6 tiek sajaukti un inkubēti dažādu [α-32P] NTP klātbūtnē standarta NMPilācijas testā.(A, augšā) Ar Kumassi iekrāsots nsp9-His6, kas atdalīts ar SDS-PAGE.(A, apakšā) Tā paša gela laukuma autoradiogrāfija.(B) Relatīvā aktivitāte (vidējais ± SEM) norādītā nukleotīdu kofaktora klātbūtnē tiek noteikta no trim neatkarīgiem eksperimentiem.*P≤0,05.(C) Metāla jonu loma.Parādīts standarta NMPilācijas tests [α-32P] UTP un dažādu metālu jonu klātbūtnē, katrs ar koncentrāciju 1 mM.C attēlā augšpusē ir parādīts Coomassie iekrāsots nsp9-His6, un C, apakšā, ir parādīta atbilstošā autoradiogrāfija.Iezīmētā proteīna izmērs (kilodaltonos) ir parādīts pa kreisi no A un C. (D) HCoV-229E nsp12-His6 mutācijas forma, kas satur norādīto aminoskābju aizvietošanu, atrodas [α-32P]UTP, kā aprakstīts sadaļā Materiāli un metodes.Radioaktīvi iezīmētais nsp9-His6, kas iegūts NMPilācijas reakcijā, tiek noteikts ar fosforilācijas attēlveidošanu (D, augšā).Relatīvā aktivitāte salīdzinājumā ar savvaļas tipa (wt) proteīnu ir parādīta D, un apakšā tiek ņemts vidējais rādītājs (± SEM) no trīs neatkarīga eksperimenta.Zvaigznītes norāda uz nekonservētu atlikumu aizstāšanu.(E) Vīrusa titru p1 šūnu kultūras supernatantā, kas iegūts 24 stundas pēc inficēšanās, noteica ar plāksnes testu.Ir norādītas kodonu aizvietošanas konstruētā HCoV-229E mutanta NiRAN domēnā (atlieku numerācija ir balstīta uz to atrašanās vietu pp1ab).Kā kontrole tika izmantots RdRp aktīvās vietas mutants nsp12_DD4823/4AA ar replikācijas deficītu.
Lai iegūtu dziļāku izpratni par NiRAN aktīvo vietu un noteiktu atlikumus, kas saistīti ar nsp9 specifiskās NMP transferāzes aktivitāti, mēs veicām mutāciju analīzi, kurā nomainījām konservatīvos atlikumus NiRAN AN, BN un CN motīvos ( 16) Tas ir Ala (SI pielikums, S2 attēls).Turklāt divos gadījumos tika novērtēta konservatīvo Arg-to-Lys vai Lys-to-Arg aizvietojumu ietekme.Kā (negatīva) kontrole koronavīrusu un citu ligzdotu vīrusu NiRAN domēnā atliekas, kas nav vai ir mazāk konservētas, tiek aizstātas ar Ala. Aizstāj K4116A (motīvā preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motīvs). BN) un D4280A (CN) ievērojami samazina vai pat novērš nsp9 NMPilāciju caur nsp12, savukārt olbaltumvielas ar konservatīvām aizstāšanām (R4178K) , K4116R) saglabā 60% un 80% savas aktivitātes, kas norāda uz ierobežojumu atvieglošanu to attiecīgajā pusē. ķēdes ir fizikāli ķīmiski jutīgas (3.D attēls).Vairāku citu konservētu atlikumu E4145A, D4273A, F4281A un D4283A aizstāšana ir daudz mazāk kaitīga, un nsp9 UMPilācija ir tikai mēreni samazināta.Līdzīgi rezultāti tika iegūti nsp9 NMPilācijas reakcijās, kurās iesaistīti citi NTP (attēls 3D un SI pielikums, S3 attēls), apstiprinot, ka novērotā ietekme uz specifiskām aminoskābju aizvietotājiem nav atkarīga no izmantotā nukleotīdu kopsubstrāta veida.Pēc tam mēs pārbaudījām šo nsp12 aizvietojumu iespējamo ietekmi uz koronavīrusu replikāciju šūnu kultūrā.Šim nolūkam mēs izmantojām atbilstošas ģenētiski modificētas komplementāras DNS (cDNS) veidnes, kas klonētas rekombinantā vaccinia vīrusā (23, 24), lai transkribētu 5–7 šūnas.Šajās šūnās ražoto infekciozo vīrusu pēcnācēju titrēšana parādīja, ka vairums HCoV-229E NiRAN mutantu nebija iespējami (3.E attēls).Dzīvotnespējīgu vīrusu mutantu grupa ietver alternatīvas, kurām ir pierādīts, ka tās novērš vai ievērojami samazina NMP transferāzes aktivitāti in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), taču ir arī divas citas alternatīvas (K4116R, E4145A). % rezervēts?To in vitro NMPilācijas aktivitāte liecina, ka ir iesaistīti papildu ierobežojumi.Tāpat divas citas mutācijas (R4178K, F4281A), kas izraisīja mērenu NiRAN in vitro NMPilācijas aktivitātes samazināšanos, radīja dzīvus vīrusus, tomēr šie vīrusi replikācijas ceļā ievērojami samazināja titrus.Saskaņā ar in vitro aktivitātes datiem, kas parādīti 3.D attēlā, aizstājot četras citas atliekas, kas nav saglabājušās koronavīrusā un/vai citos ligzdotajos vīrusos (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), radīja dzīvotspējīgus vīrusus. mēreni samazināts titrs, salīdzinot ar savvaļas tipa vīrusu (3.E attēls).
Lai noskaidrotu, vai NiRAN mediētās NMP transferāzes aktivitāte ir atkarīga no aktīvā RdRp domēna, divi konservētie Asp atlikumi, kas iesaistīti divvērtīgo metālu jonu koordinēšanā (11) RdRp motīvā C, tika aizstāti ar Ala. Iegūtais proteīns nsp12_DD4823/4AA saglabājas. tā nsp9 NMPilācijas aktivitāte, kas norāda, ka nsp12 mediētai in vitro nsp9 NMPilācijas aktivitātei nav nepieciešama polimerāzes aktivitāte (SI pielikums, S4 attēls).
Pēc nsp9 specifiskās NMP transferāzes aktivitātes noteikšanas nsp12, mēs mēģinājām raksturot NMP-nsp9 adduktu ar masas spektrometriju (MS).Pilns rekombinantā HCoV-229E nsp9 proteīna masas spektrs uzrādīja maksimumu pie 12 045 Da (4.A attēls).Nsp12 pievienošana nemainīja nsp9 kvalitāti, norādot, ka nsp12 un nsp9 izmantotajos apstākļos (denaturācija) neveidotu stabilu kompleksu (4.A attēls).UTP un GTP klātbūtnē reakcijas masas mērīšana, kas satur attiecīgi nsp9 un nsp12, parādīja, ka UTP proteīna masa pārvietojās par 306 Da un GTP proteīna masa pārvietojās par 345 Da, norādot, ka katra nsp9 molekula saistās ar UMP vai GMP. (4. attēls) C un D).Tiek spekulēts, ka enerģija, kas nepieciešama NiRAN mediētajai nsp9 NMPilācijai, nāk no NTP hidrolīzes un pirofosfāta izdalīšanās.Lai gan šajā reakcijā tika izmantots nsp9 (mērķa) molārais pārpalikums 10 reizes nekā nsp12 (enzīms), tika novērota gandrīz pilnīga nsp9 NMPilācija, kas liecina, ka mijiedarbība starp nsp12 un nsp9 ir īslaicīga un nsp12 var NMPilēt vairāk nsp9. in vitro molekula.
Viena nsp9 NMPilācija nsp12 un UTP vai GTP klātbūtnē.Parādīts HCoV-229E nsp9 (SI pielikums, S1 tabula) (AD) dekonvolucētais pilnais proteīna masas spektrs.(A) nsp9 atsevišķi, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP klātbūtnē, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP klātbūtnē.
Lai noteiktu nsp9 atlikumus, ko UMPilēja ar nsp12, nsp9-UMP tika šķelts ar tripsīnu.Iegūtie peptīdi tika atdalīti ar nanoaugstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) un analizēti ar tandēma masas spektrometriju (MS/MS) tiešsaistē.Datu analīze, izmantojot Byonic programmatūras pakotni (Protein Metrics), parādīja N-gala aminoskābes UMPilāciju.Tas tiek apstiprināts manuāli.Prekursora peptīda [UMP] NNEIMPGK (SI pielikums, S5A attēls) tandēma masas spektrs atklāja fragmentu pie 421 m/z, norādot, ka UMP saistās ar nsp9 1. atlikumu.
Nsp9 N-galā Asn ir saglabājies starp Orthocoronavirinae locekļiem (SI pielikums, S6 attēls).Lai gan mēs uzskatām, ka N-gala primārais amīna slāpeklis ir visticamākais UMP akceptors, mēs nolēmām iegūt papildu pierādījumus par NMP saistīšanos N-galā.Šī iemesla dēļ ne-NMPilēts un NMPilēts N-gala peptīds nsp9, kas attīrīts ar HPLC, tika iegūts acetona un nātrija ciānborohidrīda klātbūtnē.Šādos apstākļos tikai brīvos primāros amīnus var modificēt ar propilu (25).N-gala nsp9 atvasinātais peptīds ar secību NNEIMPGK satur divus primāros amīnus, vienu Asn N-galā un otru Lys sānu ķēdē C-galā.Tāpēc propilgrupas var ievadīt abos galos.Ne-NMPilētu peptīdu ekstrahētās jonu hromatogrammas ir parādītas SI pielikumā, S5B attēlā.Kā gaidīts, var identificēt N-gala un C-termināla (mono)propilētus (SI papildinājums, S5B attēls, augšējā josla) un dipropilētos peptīdus (SI papildinājums, S5B attēls, apakšējā josla).Šis modelis mainās, izmantojot nsp9 NMPilētu N-gala peptīdu.Šajā gadījumā var identificēt tikai C-gala propilētos peptīdus, bet N-gala propilētie peptīdi un dipropilētie peptīdi nav identificēti (SI pielikums, S5C attēls), kas norāda, ka UMP ir pārnests uz N-gala primāro amīnu Lai to novērstu. grupai veikt izmaiņas.
Pēc tam mēs aizstājam (ar Ala vai Ser) vai izdzēšam konservētos atlikumus nsp9 N-galā, lai definētu mērķa specifiskus ierobežojumus.Pamatojoties uz mūsu MS datiem, kas parāda, ka NiRAN veido nsp9-NMP aduktu ar nsp9 N-gala atlikuma primāro amīnu, mēs izvirzījām hipotēzi, ka nsp9 NMPilācijai ir nepieciešama vīrusa galvenā proteāze (Mpro, nsp5), lai atbrīvotu nsp9 N-terminālu no nsp9. tā poliproteīna prekursors.Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs ražojām prekursorproteīnu nsp7-11, kas satur nsp9 E. coli, un veicām standarta NMPilācijas testu [α-32P] UTP klātbūtnē (materiāli un metodes).Kā parādīts 5.A attēlā (3. josla), nesagrieztais nsp7-11 prekursors nav radioaktīvi iezīmēts ar nsp12.Turpretim, ja nsp7-11 šķeļ ar rekombinanto nsp5, lai atbrīvotu nsp9 (un citus nsp) no prekursora, tiek atklāts radioaktīvi iezīmēts proteīns, kas migrē kopā ar nsp9, apstiprinot mūsu secinājumu, ka NiRAN un N-selektīva kovalento nsp9-NMP adduktu veidošanās. .N-gala Asn gala primārais amīns (3825. pozīcija pp1a/pp1ab).Šo secinājumu apstiprina arī eksperimenti, izmantojot nsp9 konstrukciju, kas satur vienu vai divus papildu atlikumus N-galā.Abos gadījumos tika atcelta nsp9 ar NiRAN starpniecību saistīta UMPilācija (SI pielikums, S7 attēls).Pēc tam mēs izveidojām proteīnu ar vienu vai diviem Asn atlikumiem, kas tika izdzēsti no 3825-NNEIMPK-3832 peptīdu secības nsp9 N-galā.Abos gadījumos nsp9 UMPilācija tika pilnībā bloķēta (5.B attēls), sniedzot papildu pierādījumus tam, ka īstais nsp9 N-gals darbojas kā NMP receptors.
Nsp9 proteolītiskā apstrāde un N-gala atlikumu loma nsp12 mediētā UMPilācijā.(A) nsp9 UMPilācijai ir nepieciešams brīvs nsp9 N-termināls.Nsp7-11-His6 tiek iepriekš inkubēts 30 ° C temperatūrā NMPilācijas noteikšanas buferī, kas satur UTP rekombinantā Mpro (nsp5-His6) klātbūtnē vai bez tā.Pēc 3 stundām sāciet NMPilācijas testu, pievienojot nsp12-His6, kā aprakstīts sadaļā Materiāli un metodes.Reakcija, kas satur nsp5-His6 (1. josla) un nsp9-His6 (2. josla), tika izmantota kā kontrole.Pēc 10 minūtēm reakcija tika pārtraukta un reakcijas maisījums tika atdalīts ar SDS-PAGE.Olbaltumviela tika iekrāsota ar Coomassie Brilliant Blue (A, augšpusē).Labajā pusē ir parādīts Nsp7-11-His6 prekursors un apstrādātais produkts, kas iegūts nsp5-His6 mediētas šķelšanās rezultātā.Lūdzu, ņemiet vērā (to mazā izmēra dēļ), ka nsp7 un nsp11-His6 šajā gēlā nav nosakāmi, un reakcija tiek papildināta ar nsp5-His6 (1. un 4. josla; nsp5-His6 atrašanās vieta ir norādīta ar cietu apli) vai nsp9-His6 (2. josla) satur nelielu daudzumu MBP (norādīts ar atvērtiem apļiem) kā atlikušos piemaisījumus, jo tie ir izteikti kā MBP saplūšanas proteīni (SI pielikums, S1 tabula).(B) Nsp9-His6 variantam trūkst viena vai divu N-gala Asn atlikumu (atlieku numerācija atbilstoši pozīcijai pp1a / pp1ab), un to attīra un inkubē ar nsp12-His6 un [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE, kas iekrāsota ar Coomassie, ir parādīta augšpusē, B, atbilstošais autoradiogrāfs ir parādīts apakšā.Molekulmasas marķiera pozīcija (kilodaltonos) ir parādīta kreisajā pusē.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-gala konservētie atlikumi tika aizstāti ar Ala vai Ser, un tāds pats proteīna daudzums tika izmantots nsp12-His6 mediētajā UMPilācijas reakcijā.Reakcijas produkti tika atdalīti ar SDS-PAGE un iekrāsoti ar Coomassie Brilliant Blue (C, augšpusē), un radioaktīvi iezīmētais nsp9-His6 tika noteikts ar fosforescences attēlveidošanu (C, vidū).Izmantojot savvaļas tipa (masas) proteīnu kā atsauci (iestatīts uz 100%), relatīvā NMPilācijas aktivitāte (vidējais ± SEM) tika aprēķināta no trim neatkarīgiem eksperimentiem.(D) Vīrusu titrus p1 šūnu kultūras supernatantā Huh-7 šūnām, kas inficētas ar HCoV-229E savvaļas tipa Huh-7 šūnām, un mutantiem, kas satur noteiktas aminoskābju aizvietošanas nsp9, noteica ar plāksnes testu.Kā negatīva kontrole tika izmantots RdRp motīva C dubultais mutants DD4823/4AA ar replikācijas deficītu.
Nsp9 N-gals (īpaši 1., 2., 3. un 6. pozīcija) ir ļoti konservēts Orthocoronavirinae apakšdzimtas locekļu vidū (SI pielikums, S6 attēls).Lai izpētītu šo atlikumu iespējamo lomu nsp12 mediētajā nsp9 NMPilācijā, divi secīgi Asn atlikumi nsp9 N-galā tika aizstāti ar Ala vai Ser (atsevišķi vai kombinācijā).Salīdzinot ar savvaļas tipa nsp9, N3825 aizstāšana ar Ala vai Ser izraisīja nsp12 mediētās UMPilācijas samazināšanos vairāk nekā divas reizes (5.C attēls).Saskaņā ar mūsu secinājumu, ka NMPilācija notiek N-gala primārajā amīnā, nevis N-gala atlikuma sānu ķēdē, mēs novērojām ievērojamu atlikušo NMPilāciju, aizstājot N3825A un N3825S.Interesanti, ka, ja otro Asn aizstāj ar Ala vai Ser, nsp9 UMPilācija tiek samazināta spēcīgāk (vairāk nekā 10 reizes), savukārt Ala aizstāšanai 3., 4. un 6. pozīcijā ir tikai mērena ietekme uz nsp9 UMPilāciju (2. attēls). ) .5C).Līdzīgi rezultāti tika iegūti, izmantojot ATP, CTP vai GTP (SI pielikums, S8 attēls).Kopumā šie dati norāda uz N2826 (nsp9 2. pozīcija) galveno lomu nsp9 NMPilācijā.
Lai iegūtu papildu pierādījumus par funkcionālo korelāciju starp nsp9 N-galu un NMPilāciju, mēs veicām koronavīrusu saimes nsp9 sekvences vairāku secību izlīdzināšanu (MSA) (svārstās no 104 līdz 113 atlikumiem) (SI pielikums, attēls S6).Kopumā 47 (zināmās un domājamās) sugās no 5 Orthocoronavirinae apakšdzimtas ģintīm, kas inficē dažādus zīdītājus, putnus un rāpuļu saimniekus, kopumā tikai 8 atliekas tika konstatētas kā nemainīgas.Visplašākās izmaiņas, ieskaitot dzēšanas un ievietošanas, tika novērotas ciklos starp nsp9 sekundārās struktūras elementiem, kā noteikts iepriekšējos strukturālos pētījumos (26 ± 28).Nsp9 C-gala daļas β virknē un α spirālē tika atrasti pieci nemainīgi atlikumi.Trīs nemainīgi atlikumi veido nsp9 N gala NNE motīvu.Tiek atklāts, ka šī motīva otrais Asn ir vienīgais nemainīgais atlikums, kas ir kopīgs arī tālu radniecīgā varžu koronavīrusa hipotētiskajam nsp9, un tas pārstāv Microhyla letovirus 1 sugu Alphaletovirus Letovirinae apakšdzimtā.Atlikumu saglabāšanu nsp9 sekundārās struktūras elementos var racionalizēt ar strukturāliem apsvērumiem, lai saglabātu locīšanas vai zināmās RNS saistīšanās īpašības.Tomēr šķiet, ka šis arguments neattiecas uz NNE saglabāšanu, un pirms šī pētījuma ierobežojumu raksturs, kas ierobežo tripeptīdu secības variācijas, bija pilnībā neskaidrs.
Lai noteiktu nsp9-NMPilācijas un NNE saglabāšanas nozīmi koronavīrusa replikācijā, mēs ražojām HCoV-229E mutantus, kas satur vienu vai dubultu nsp9 N-gala atlieku aizvietošanu, norādot, ka nsp9 NMPilācija ir kaitīga in vitro.Pirms sākam, mēs cenšamies atbildēt uz jautājumu, vai šīs aizvietošanas (netālu no nsp8 | 9 šķelšanās vietas) ietekmē C-termināla pp1a reģiona proteolītisko apstrādi.Nsp7-11 poliproteīna konstrukciju komplekts, kas satur atbilstošas aizvietošanas nsp9 N-galā, tika ražots E. coli un sagriezts ar rekombinanto Mpro.Četru vietu proteolītisko šķelšanos (ieskaitot nsp9 blakus esošo vietu) būtiski neietekmē nekādas ieviestās aizstāšanas (SI pielikums, S9 attēls), izņemot strukturālās izmaiņas šajos proteīnos, kas traucē Mpro mediēto nsp8 | 9 šķelšanos (vai citu) tīmekļa vietne.
Huh-7 šūnas tika transficētas ar genoma garuma HCoV-229E RNS, kas kodē Ala vai Ser aizvietojumus konservētajos NNE tripeptīdos (N3825, N3826 un E3827) nsp9 N galā, parādot, ka lielākā daļa mutāciju ir letālas.Mēs varējām izglābt vīrusu, aizstājot N-gala Asn (N2835A vai N2835S) Ser vai Ala, bet neizdevās atgūt vīrusu ar citām vienreizējām un dubultajām mutācijām NNE secībā (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (5.D attēls).
Šie rezultāti liecina, ka koronavīrusu replikācija audu kultūrā ir ierobežota (tāda pati vai līdzīga), ierobežojot nsp9 NMPilācijas vietu dabisko mutāciju organismā un atbalstot šīs reakcijas galveno lomu koronavīrusu dzīves ciklā.
Pēdējā eksperimentu komplektā mēs ražojām C-gala His6 iezīmētu SARS-CoV-2 nsp12 un nsp9 un divas nsp12 mutācijas formas E. coli.Aktīvās vietas atlikumi NiRAN un RdRp domēnos bija attiecīgi Izmantojiet Ala (6.A attēls un SI pielikums, S2 tabula).K4465 SARS-CoV-2 nsp12 atbilst K4135 HCoV-229E (SI pielikums, S2 attēls), kas izrādījās vajadzīgs NiRAN aktivitātei un HCoV-229E replikācijai (3D un E attēls).Šis atlikums atbilst arī arteriālā vīrusa EAV nsp9 K94 atlikumam, kas iepriekš tika pierādīts kā nepieciešams NiRAN paš-UMPilācijai / paš-GMPilācijai (16).Kā parādīts 6.B attēlā, SARS-CoV-2 nsp12 ir UMP transferāzes aktivitāte, izmantojot nsp9 kā substrātu, savukārt nsp12_K4465A aktīvās vietas mutants ir neaktīvs.Divkāršā aizstāšana SDD raksturīgajā RdRp motīva C secībā neietekmē UMP transferāzes aktivitāti (6.B attēls), norādot, ka RdRp aktivitātei nav tiešas ietekmes uz nsp9 UMPilāciju.Līdzīgi dati tika iegūti, izmantojot CTP, GTP un ATP (SI pielikums, S10 attēls).Rezumējot, šie dati liecina, ka NiRAN mediētajai nsp9 NMPylācijai ir konservatīva aktivitāte koronavīrusos, kas pārstāv dažādas ortokoronavīrusu apakšģimenes ģintis.
SARS-CoV-2 nsp12 mediēta nsp9 NMPilācija.(A) Coomassie iekrāsots SDS-poliakrilamīda gēls, kas parāda NMPilācijas testā izmantoto rekombinanto proteīnu.Kā kontrole tika izmantots mutants proteīns ar aktīvās vietas aizstāšanu SARS-CoV-2 nsp12 NiRAN domēnā (K4465A) un RdRp domēnā (DD5152/3AA).Atlikumu numerācija ir balstīta uz pozīciju pp1ab.(B) UMPilācijas noteikšanas autoradiogrāfija, izmantojot nsp9-His6 un [α-32P]UTP kā nsp12-His6 (savvaļas tipa [wt] un mutants) substrātu.Kreisajā pusē ir parādīta iezīmētā proteīna molekulmasa (kilodaltonos).
NiRAN domēni parasti ir konservēti Nidovirales (16), norādot, ka tie katalizē enzīmu reakcijas, kas ir būtiskas Nidovirus replikācijai.Šajā pētījumā mēs varējām pierādīt, ka koronavīrusa NiRAN domēns pārnes NMP (ģenerēts no NTP) uz nsp9, noslēpumainu RNS saistošu proteīnu, kas iesaistīts vīrusa replikācijā (26 ?? 29 ), lai noteiktu to kā dabisku mērķi un koronavīrusa RTC partneris.
NiRAN domēnam ir trīs secību motīvi (AN, BN un CN), kas satur ļoti nelielu skaitu atlikumu, kas ir konservēti visās ģimenēs monofiliskā, bet ļoti diferencētā Nidovirales secībā (8, 16).Jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka tie ir strukturāli saistīti ar lielākoties neraksturīgu proteīnkināzei līdzīgu proteīnu saimi, ko sākotnēji sauca par SelO ģimeni (17, 19, 22, 30, 31).Ar SelO saistītajiem proteīniem ir kināzes krokas, taču tiem trūkst vairāku konservētu aktīvās vietas atlikumu klasiskajās kināzēs (22, 32).Pamatojoties uz to ATP molekulu apgriezto orientāciju, kas saistītas ar aktīvo vietu un stabilizētas ar specifiskām mijiedarbībām, tika izvirzīta hipotēze un pēc tam apstiprināts, ka SelO pārnes AMP (nevis fosfātu) uz proteīna substrātu (22), savukārt citam baktēriju SelO līdzīgam proteīnam YdiU ir. nesen tika pierādīts, ka tas katalizē UMP kovalento piesaisti dažādu olbaltumvielu substrātu Tyr un His atliekām (33).
Lai apstiprinātu un paplašinātu koronavīrusa NiRAN domēna iespējamās aktīvās vietas atlieku prognozi, mēs izmantojām bioķīmiskās un reversās ģenētikas metodes, lai veiktu koronavīrusa nsp12 mutāciju analīzi (3D attēls un E un SI pielikums, S3 attēls un tabula) S1â S4).Dati liecina, ka HCoV-229E K4135, R4178 un D4280 aizstāšana ar Ala novērš in vitro NMP transferāzes aktivitāti un vīrusa replikāciju šūnu kultūrā (3.D attēls un E un SI pielikumi, S3 attēls), apstiprinot to klātbūtni NTP γ-fosfātā. ( K4135, R4178) un aktīvās vietas metālu jonu koordināciju (D4280).Konservētā Glu E4145A aizstāšana putnu ligzdas vīrusa diapazonā, kā prognozēts, stabilizēs K4135 (17) pozīciju, novērš vīrusa replikāciju, taču pārsteidzoši, ka aktivitāte tika saglabāta in vitro NMPilācijas testā (3.D un E attēls un SI pielikums, S3 attēls un S1–S4 tabulas).Līdzīgs novērojums tika veikts, kad tika ieviesta atbilstošā aizstāšana Salmonella typhimurium (E130A) YdiU homologā (33).Kopumā šie dati atbalsta šī konservētā atlikuma regulatīvo funkciju, nevis katalītisko funkciju.
Konservētā Phe atlikuma (F4281A) aizstāšana nestovīrusa diapazonā HCoV-229E NiRAN domēnā (8) izraisīja NMPilācijas aktivitātes samazināšanos in vitro un ievērojamu vīrusa replikācijas samazināšanos šūnu kultūrā (3D, E un SI attēls). pielikums, S3 attēls).Dati atbilst šī atlikuma svarīgajai regulējošajai funkcijai, piemēram, iepriekš parādītajam homologajam DFG motīva Phe atlikumam.Klasiskajās proteīnkināzēs tā ir daļa no Mg2+ saistošās cilpas un palīdz salikt un regulēt mugurkaulu???Nepieciešams efektīvai katalītiskajai darbībai (32, 34).K4116 atlikumu (preAN motīvā) aizstāšana ar Ala un Arg attiecīgi likvidēja vīrusa replikāciju, un, kā gaidīts, tam bija atšķirīga ietekme uz NMP transferāzes aktivitāti in vitro atkarībā no ieviestās aminoskābju sānu ķēdes (3D un E un SI pielikumi). , S3 attēls).Funkcionālie dati atbilst strukturālajai informācijai, kas norāda, ka šis atlikums ir izveidojis mijiedarbību ar ATP fosfātu (17).Citu ligzdotu vīrusu ģimeņu NiRAN domēnā HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 pozīciju aizņem Lys, Arg vai His (8), norādot, ka šī specifiskā atlikuma funkcionālais ierobežojums ir atvieglots.D4188A un D4283A aizstāšana novērš vai stipri samazina enzīmu aktivitāti un novērš vīrusa replikāciju (3. attēls).Šie divi atlikumi ir konservēti lielākajā daļā (bet ne visos) ligzdoto vīrusu (8), norādot uz svarīgu ģimenei raksturīgu, bet, iespējams, nekatalītisku funkciju.Kā kontroles tika izmantotas vairāku citu Lys un Asp atlikumu (K4113A, D4180A, D4197A un D4273A) Ala aizvietojumi, kas nav konservēti Coronaviridae vai citās Nestioviridae ģimenēs (8).Kā gaidīts, šīs aizvietošanas lielā mērā ir pieļaujamas, dažos gadījumos nedaudz samazinoties enzīmu aktivitātei un vīrusa replikācijai (3. attēls un SI pielikums, S3 attēls).Kopumā koronavīrusa mutaģenēzes dati ļoti atbilst EAV NiRAN-RdRp (16) paš-GMP un reversās ģenētikas datiem, kuros svarīgas funkcijas veic EAV nsp9 (koronavīrusa nsp12 ortologs) atlikums K94 (atbilst HCoV-229E K4135), R124 (atbilst R4178), D132 (atbilst D4188), D165 (atbilst D4280), F166 (atbilst F4281).Turklāt HCoV-229E mutaģenēzes dati atbilst iepriekš ziņotajiem SARS-CoV reversās ģenētikas datiem (16), un tie ir tikpat līdzīgi tiem, kas novēroti atbilstošajam CN motīvam Phe-to-Ala mutantam SARS-CoV_nsp12. aprakstītais fenotips -F219A un HCoV-229E_F4281A (3. attēls D un E un SI pielikums, S3 attēls un S1-S4 tabula).
Salīdzinot ar EAV ortologiem (16), kuriem nepārprotami ir priekšroka UTP un GTP (paš-NMPilācijas reakcijā), mūsu pētījums parāda, ka koronavīrusa NiRAN domēnu (ko pārstāv HCoV-229E un SARS-CoV-2) var efektīvi izmantot. pārsūtīti Visi četri NMP, lai gan ir neliela priekšroka UMP (1. un 3. attēls).Konkrētā NTP kopsubstrāta relatīvi zemā specifika atbilst nesen ziņotajai SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompozīta struktūrai, kurā ADP-Mg2+ saistās ar NiRAN aktīvo vietu, bet ne ar adenīna daļu. specifisku mijiedarbību veidošanās (17).Mūsu pētījumā NMPilācijas reakcijā izmantotajam nukleotīda veidam nav atšķirīgas ietekmes uz mutanta proteīna aktivitāti (SI pielikums, S3 attēls), norādot, ka neviens no šiem atlikumiem nav cieši saistīts ar konkrētas nukleobāzes saistīšanos.Vēl ir jāizpēta dažādu NTP kopsubstrātu preferenču strukturālā bāze un iespējamā bioloģiskā nozīme, kas novērota koronavīrusu un arteriālo vīrusu NiRAN domēnos;tie var būt patiesi vai to attiecīgo pētījumu ierobežojumu dēļ.Šobrīd nevar izslēgt, ka arteriālā vīrusa NiRAN domēna potenciālajai NMPylator aktivitātei (salīdzinājumā ar iepriekš raksturoto paš-NMPilācijas aktivitāti) ir atšķirīga līdzsubstrāta izvēle, ņemot vērā, ka līdzība starp arteriālo un koronavīrusu. NiRAN domēns ir sasniedzis ierobežojumu.Uz secību balstīts salīdzinājums (16).Salīdzinot ar pseidokināzi SelO, kas izmanto Mg2+ kā kofaktoru, koronavīrusa un arteriālā vīrusa NiRAN aktivitāte ir atkarīga no Mn2+ (16) (3.C attēls un SI pielikums, S1 attēls).Atkarība no Mn2+ un acīmredzama priekšroka UTP ir neparasta proteīna NMPilatoru iezīme, un tikai nesen tā tika apstiprināta Salmonella typhimurium YdiU proteīnā, kas katalizē stingru no Mn2+ atkarīgo proteīna chaperona UMPylāciju, lai aizsargātu šūnas no stresa indukcijas Šūnu ATP baseins ( 33).
Nesen aprakstītā strukturālā līdzība starp koronavīrusa NiRAN domēnu un šūnu proteīnu kināzēm (17, 19) sniedz papildu atbalstu NiRAN spējai kovalenti saistīt NMP ar citiem proteīniem, par kuriem esam ziņojuši šajā pētījumā.Mēs koncentrējāmies uz iespējamo NiRAN mērķu meklēšanu uz proteīniem, ko kodē HCoV-229E ORF1a, kas, kā zināms, tieši vai netieši palīdz RTC ORF1b kodētajai replikāzei (12, 35).Mūsu eksperimenti sniedz pārliecinošus pierādījumus efektīvai un specifiskai nsp9 NMPilācijai (2. attēls).Ja mērķa proteīnu lieto molārā pārpalikumā, kas ir 8 līdz 10 reizes lielāks nekā enzīma (nsp12), tiek apstiprināts, ka nsp9 ir pilnībā (mono)NMPizēts (4. attēls).Mēs secinājām, ka mijiedarbība starp nsp12 un nsp9 ir īslaicīga un neveido stabilu kompleksu ar nsp9 (ja nav citu RTC apakšvienību).Šo secinājumu apstiprina proteīnu mijiedarbības pētījumi par SARS-CoV proteomu (35).MS analīze identificēja nsp9 N-gala atlikuma primāro amīnu kā NMPilācijas vietu (SI pielikums, S5 attēls).Fosforamidāta saites un N-gala aminogrupas veidošanās atšķir NiRAN-mediēto NMPilācijas aktivitāti no Pseudomonas syringae SelO-mediētās AMPilācijas reakcijas, kas katalizē O-saistīta AMP veidošanos Ser, Thr vai Tyr atlieku peptīdu adduktā ( 22), un S. typhimurium YdiU veido O-saistītus (ar Tyr) un N-saistītus (ar His) peptīdu-UMP adduktus.Ierobežotā informācija, kas pieejama par SelO proteīnu saimi, liecina, ka šīs lielās olbaltumvielu saimes locekļi ļoti atšķiras peptīdu-NMP adduktu veidošanā.Šis ir interesants novērojums, kas ir pelnījis turpmāku izpēti.
Šajā pētījumā iegūtie dati lika mums izvirzīt hipotēzi, ka nsp9 NMPilācijai ir nepieciešams brīvs N-gals.Vīrusa replikācijas kontekstā to nodrošinās nsp8|nsp9 apstrādes vietas proteolītiskā šķelšanās replikācijas poliproteīnā pp1a, ko mediē Mpro un pp1ab.Vairumā koronavīrusu atšķirība starp šo konkrēto vietu (HCoV-229E VKLQ|NNEI) un visām pārējām koronavīrusa Mpro šķelšanās vietām ir tāda, ka Asn (nevis cits neliels atlikums, piemēram, Ala, Ser vai Gly) aizņem P1â???Atrašanās vieta (36).Agrīnajos pētījumos iegūtie peptīdu šķelšanās dati parādīja, ka nsp8|nsp9 vietas šķelšanās efektivitāte bija zemāka nekā citām vietām, norādot, ka 1) šai konkrētajai vietai var būt regulējoša loma savlaicīgā koordinētā C-termināla apstrādē. pp1a reģions vai 2) a Īpašā konservētā nsp9 N-gala loma vīrusa replikācijā (37).Mūsu dati (attēls 5A) parādīja, ka nsp9 rekombinantā forma, kas satur īsto N-gala secību, tika efektīvi NMPizēta ar nsp12.N-gala blakus secība tika noņemta ar faktoru Xa (nsp9-His6; SI pielikums, S1 tabula) vai ar Mpro mediētu šķelšanos (nsp7-11-His6; 5.A attēls un SI pielikums, S1 tabula).Svarīgi, ka nesagrieztais nsp9 saturošais prekursors nsp7-11-His6 uzrādīja izturību pret nsp12 NMPilāciju, kas atbilst mūsu datiem, norādot, ka nsp9-NMP addukts veidojas caur N-gala primāro amīnu (SI pielikums, S5 attēls) .Lai iegūtu dziļāku izpratni par NiRAN substrāta specifiku, mēs koncentrējāmies uz blakus esošajiem nsp9 N-termināla atlikumiem.Ja nav citu proteīnu, tie ir strukturāli elastīgi, neļaujot tos atklāt nemarķētā nsp9 formā (26, 28, 38), norādot uz to ierobežoto dabisko variāciju. Tas ir saistīts ar svarīgo secību specifisko (nav ar sekundāro struktūru saistīto) nsp9 N-gala fragmenta funkcija.Konservēto atlieku Ala aizstāšanas šajā reģionā (attēls 5C un D un SI pielikums, S8 attēls) atklāj, ka N3826 ir būtisks nsp9 NMPilācijai in vitro, savukārt N3825A un E3827A aizstāšana izraisa NMPilācijas samazināšanos, savukārt M3829A un P3830 aizvietojumi to nedara. .Acīmredzot ietekmē nsp9 NMPilāciju.Lai gan N-gala Asn (N3825A, N3825S) aizstāšanai ir tikai mērena ietekme uz nsp9 NMPilāciju un vīrusa replikāciju šūnu kultūrā (5.C un D attēls), Asn atlikuma sekvences dzēšana no N-termināla 3825-NN dipeptīda Tas ir nāvējošs vīrusiem, norādot, ka viens Asn atlikums ir nepieciešams pirms cita atlikuma N-galā, vēlams Asn, lai gan šķiet, ka līdzīgu atlieku aizstāšana var būt daļēji pieļaujama (5.B, C un D attēls).Mēs secinām, ka 3825-NN dipeptīds, īpaši konservētais un būtiskais N3826 atlikums koronavīrusa diapazonā (SI pielikums, S6 attēls), nodrošina pareizu nsp9 N-gala saistīšanos un orientāciju NiRAN aktīvajā vietā.
Aizstājot visu apakšgrupu konservēto Glu ar Ala (E3827A), in vitro tiek saglabāta nsp9 NMPilācija, taču tā ir nāvējoša vīrusiem šūnu kultūrā (5.C un D attēls), norādot uz šī atlikuma papildu funkciju, piemēram, galvenajās mijiedarbībās (NMPilēts vai nemodificēts). ) nsp9 N-gals un citi vīrusa replikācijā iesaistītie faktori.Nsp9 mutācijas neietekmēja nsp9 vai blakus esošo nsps proteolītisko procesu (39) (SI pielikums, S9 attēls), norādot, ka vairāku novēroto nsp9 mutāciju letālos fenotipus neizraisīja C proteolītiskā procesa gala pp1a zonas disregulācija. .
Iepriekš minētie dati sniedz pierādījumus tam, ka pēc Mpro mediētas nsp8|9 šķelšanās vietas apstrādes pp1a/pp1ab nsp9 N-galu var UMPilēt (vai daļēji modificēt ar citu NMP).Turklāt nsp9 N-gala lieliskā saglabāšana (ieskaitot atsevišķos un nemainīgos Asn atlikumus koronavīrusu ģimenē) un šajā pētījumā iegūtie reversās ģenētikas dati (3E un 5D attēls) lika mums secināt, ka aprakstītā nsp9 NMPilācija ir bioloģiski radniecīgs un būtisks koronavīrusa replikācijai.Šīs modifikācijas funkcionālās sekas vēl ir jāpēta, piemēram, attiecībā uz iepriekš aprakstīto (nespecifisko) nsp9 (nemodificētā forma) RNS saistīšanās aktivitāti (2628).N-termināla NMPilācija var ietekmēt arī nsp9 mijiedarbību ar proteīna vai RNS substrātiem vai dažādu četru līmeņu komplektu veidošanos.Tie ir novēroti strukturālos pētījumos, un ir apstiprināts, ka tie ir funkcionāli saistīti ar koronavīrusa replikāciju, lai gan īpaši tad, ja šīs modifikācijas gadījumā nav (26–29, 40).
Lai gan koronavīrusa NiRAN domēna mērķa specifika joprojām ir jāraksturo sīkāk, mūsu dati liecina, ka koronavīrusa NiRAN domēna proteīna mērķa specifika ir ļoti šaura.Lai gan galveno aktīvās vietas atlikumu (8, 16) saglabāšana visu nidovīrusu ģimeņu NiRAN domēnā stingri atbalsta konservēto NMPylator šo proteīnu aktivitāti, šī domēna substrātu saistošo kabatas atlikumu identitāte. Saglabāšana un saglabāšana joprojām ir jāraksturo. un var atšķirties dažādās Nidovirales ģimenēs.Tāpat vēl ir jānosaka citu ligzdotu vīrusu attiecīgie mērķi.Tie var būt attāli nsp9 vai citu proteīnu ortologi, jo sekvences ārpus pieciem replikāzes domēniem, kas parasti ir konservētas ligzdotajos vīrusos, ir mazāk konservētas (8), tostarp genoma masīvs starp Mpro un NiRAN. Starp tiem nsp9 atrodas korona vīruss.
Turklāt mēs šobrīd nevaram izslēgt iespēju, ka NiRAN domēnam ir papildu (tostarp šūnu) mērķi.Šajā gadījumā ir vērts pieminēt, ka baktēriju homologiem šajā topošajā proteīna NMPylatoros (NMPylatoros) (30, 31), šķiet, ir “galvenie regulatori”?NMP modulē dažādus šūnu proteīnus, lai regulētu vai likvidētu to pakārtotās aktivitātes, tādējādi spēlējot lomu dažādos bioloģiskos procesos, piemēram, šūnu stresa reakcijā un redoksu homeostāzē (22, 33).
Šajā pētījumā (2. un 4. attēls un SI pielikums, S3 un S5 attēli) mēs varējām pierādīt, ka nsp12 pārnesa UMP (NMP) daļu uz vienu (konservētu) pozīciju nsp9, bet citi proteīni netika modificēti. izmantots Apstākļos tiek atbalstīta labi definēta (nevis vaļīga) substrāta specifika.Atbilstoši tam, salīdzinot ar N-termināla nsp9 NMPilāciju, nsp12 paša NMPilācijas aktivitāte ir ļoti zema, tās noteikšanai nepieciešams ilgāks autoradiogrāfijas ekspozīcijas laiks, un tiek izmantota nsp12 koncentrācijas palielināšanās 10 reizes.Turklāt mūsu MS analīze nesniedza pierādījumus par nsp12 NMPilāciju, kas liecina, ka NiRAN domēna paš-NMPilācija ir (labākajā gadījumā) sekundāra darbība.Tomēr jāatzīmē, ka citi pētījumi ir snieguši provizoriskus pierādījumus tam, ka baktēriju NMPylator pašAMPilācijas statuss var kontrolēt to NMPilācijas aktivitāti uz citiem proteīna substrātiem (22, 33).Tāpēc ir nepieciešams vairāk pētījumu, lai izpētītu iespējamo paš-NMPilācijas aktivitāšu funkcionālo ietekmi, par kurām ziņots attiecībā uz EAV nsp9 (16) un koronavīrusa nsp12 (šis pētījums), tostarp ierosinātā šaperonam līdzīgā ietekme uz C-termināla RdRp domēna locīšanu ( 16) ).
Iepriekš tika apsvērtas vairākas hipotēzes par iespējamām nidovīrusa NiRAN domēna pakārtotajām funkcijām, tostarp RNS ligāze, ar RNS ierobežotu guanilāta transferāzi un proteīnu gruntēšanas aktivitāti (16), taču neviena no tām nav saderīga ar pieejamajām pakārtotajām funkcijām.Turpmākajās pozīcijās iegūtā informācija ir tieši tāds pats laiks, neizdarot papildu pieņēmumus.Šajā pētījumā iegūtie dati visvairāk atbilst (bet nevar pierādīt), ka NiRAN domēns ir iesaistīts proteīnu izraisītas RNS sintēzes ierosināšanā.Iepriekš tika uzskatīts, ka NiRAN domēna funkcija 5??²-RNS ierobežošanas vai RNS ligācijas reakcijas neietekmē šie un citu datu atbalsts.Tāpēc, piemēram, tiek uzskatīts, ka NiRAN aktīvā vieta ietver konservēto Asp kā vispārīgu bāzi (D252 Pseudomonas syringae SelO; D4271 HCoV-229E pp1ab; D208 SARS-CoV-2 nsp12) (SI pielikums, 2. attēls) ).S2) (17, 22, 33), savukārt katalīzi no ATP atkarīgajā RNS ligāzē un RNS ierobežojošajā enzīmā veic kovalentais enzīma-(lizil-N)-NMP starpprodukts, kas ietver neizmainītu Lys atlikumu ( 41).Turklāt koronavīrusa NiRAN ievērojamā uz secību balstītā specifika attiecībā uz konservētiem proteīnu mērķiem un atslābinātā specifika NTP līdzsubstrātiem (dod priekšroku UTP) iebilst pret NiRAN mediētu ierobežojošo enzīmu vai RNS ligāzei līdzīgām funkcijām.
Acīmredzot ir nepieciešams daudz papildu darba, lai pārbaudītu un, ja tas ir pierādīts, sīkāk izstrādātu nsp9-UMP (nsp9-NMP) iespējamo lomu proteīnu inducētā RNS sintēzē, kas savienos vairākus interesantus, bet (līdz šim) ziņojumus, par kuriem ziņots iepriekš. .Atsevišķi novērojumi.Piemēram, ir noteikts, ka koronavīrusa negatīvās virknes RNS beigas sākas ar oligo(U) virkni (42, 43).Šis novērojums atbilst idejai, ka negatīvās virknes RNS sintēze tiek uzsākta, saistot nsp9 UMPilēto formu ar poli(A) asti ( trigeri), ko var veicināt tā saistīšanās ar RNS. Aktivitāte un/vai mijiedarbība ar cits RTC proteīns.UMP daļu, ko nodrošina nsp9, pēc tam var izmantot kā “praimeri” nsp7/8/nsp12 mediētai oligouridilācijai, izmantojot 3??²-poli(A) asti genoma RNS vai citu oligo (A) saturošu secību. kalpo kā veidne, līdzīgi mehānismam, kas izveidots pikornavīrusa VPg proteīnam (44).Ko darīt, ja priekšlikums ir “nenormatīvs”????(olbaltumvielu izraisītās) negatīvās virknes RNS sintēzes uzsākšana nodrošina saikni ar novērojumiem, norādot, ka koronavīrusa negatīvās virknes RNS beigās ir UMP (nevis UTP) (42), kas tiek uzskatīts par norādi uz to, ka nukleīnskābe Dicer šķeļ galu, ko fosforilē nezināma uridīnam specifiska endonukleāze.Ja tiek apstiprināts, šī nukleīnskābes hidrolītiskā aktivitāte var palīdzēt atbrīvot nsp9 oligomēru UMPilēto formu no topošās negatīvās virknes 5 ² gala.Iespējamā nsp9 loma olbaltumvielu sagatavošanā atbilst arī iepriekšējiem reversās ģenētikas pētījumiem, kas parādīja, ka nsp9 (un nsp8) kritiski un specifiski mijiedarbojas ar konservēto cis-darbības RNS elementu koronavīrusa genoma 3. gala tuvumā.45).Saskaņā ar šo ziņojumu šos iepriekšējos novērojumus tagad var pārskatīt un paplašināt, veicot turpmākus pētījumus.
Rezumējot, mūsu dati noteica patentētā ligzdotā vīrusa enzīma marķējuma specifisko aktivitāti, kas N-galā saistīts ar RdRp.Koronavīrusa gadījumā šī jaunatklātā NiRAN mediētā UMPylator/NMPylator aktivitāte tiek izmantota, lai paļautos uz Mn2+ un blakus esošajiem Asn atlikumiem un izraisītu (zemas enerģijas) fosforamidāta saišu veidošanos ar N-gala primāro amīnu.Izmantojot Mpro-mediētu šķelšanos nsp8|9 šķelšanās vietā, nsp9 mērķi var izmantot NMPilācijai, norādot uz funkcionālo savienojumu starp proteāzi un NiRAN domēnu, kas sniedzas līdz RdRp.Galveno atlieku saglabāšana nsp12 NiRAN aktīvajā vietā un nsp9 mērķī, apvienojumā ar datiem, kas iegūti no diviem koronavīrusiem, tostarp SARS-CoV-2, sniedz pārliecinošus pierādījumus tam, ka nsp9 NMPylation ir koronavīruss. Konservatīvas iezīmes ir arī galvenais solis vīrusa replikācijā.Pieejamie dati liek mums secināt, ka nsp9 NMPilētās formas īpašā loma proteīnu inducētā RNS sintēzē ir saprātīgs scenārijs koronavīrusam un citiem ligzdotiem vīrusiem, un NiRAN var mērķēt arī uz citiem neidentificētiem proteīniem.Regulējiet vīrusu.Saimnieka mijiedarbība.Ja apstiprināsies, proteīnu primeru iesaistīšanās vīrusa RNS sintēzē palielinās Mpro/3CLpro un RdRp domēnu sekvences afinitāti starp iepriekš atklāto koronavīrusu un pikornavīrusam līdzīgo supergrupu (9), kas tagad ir apvienoti nesen izveidotajos Pisonivirites ( 46) kategorijā.
Mūsu dati arī parāda, ka šajā pētījumā identificētās pamata, selektīvās un konservatīvās enzīmu aktivitātes var izmantot kā pretvīrusu zāļu mērķus.Savienojumus, kas traucē konservētā nsp9 N-gala saistīšanos (un sekojošu modifikāciju) NiRAN aktīvajā vietā, var izveidot par efektīvām un daudzpusīgām pretvīrusu zālēm, kas piemērotas dažādu (apakš)ģints infekciju dzīvnieku un cilvēku koronavīrusu ārstēšanai. , tostarp SARS-CoV-2 un Tuvo Austrumu respiratorā sindroma koronavīruss.
Šajā pētījumā iegūtā koronavīrusa proteīna kodējošā secība tika pastiprināta ar RT-PCR, izmantojot RNS, kas izolēta no Huh-7, kas inficēta ar HCoV-229E, vai Vero E6, kas inficēta ar SARS-CoV-2, un ievietota, izmantojot standarta klonēšanas procedūras.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) vai pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspresijas vektors (SI pielikums, S1 un S2 tabulas).Viena kodona aizstāšana tika ieviesta ar uz PCR balstītu vietni orientētu mutaģenēzi (48).Lai ražotu MBP saplūsmes proteīnu, E. coli TB1 šūnas tika transformētas ar atbilstošu pMAL-c2 plazmīdas konstrukciju (SI pielikums, S1 tabula).Sapludinātais proteīns tika attīrīts ar amilozes afinitātes hromatogrāfiju un šķelts ar faktoru Xa.Pēc tam C-gala His6 marķētais proteīns tika attīrīts ar Ni-imobilizētu metāla afinitātes hromatogrāfiju (Ni-IMAC), kā aprakstīts iepriekš (49).Lai ražotu ubikvitīna saplūšanas proteīnu, E. coli TB1 šūnas izmantoja atbilstošo pASK3-Ub-CHis6 plazmīda konstrukciju (SI pielikums, S1 un S2 tabulas) un pCGI plazmīdas DNS, kas kodē ubikvitīnam specifisko C-gala hidrolāzi 1 (Ubp1).Pārvēršana (47).C-gala His6 marķētais koronavīrusa proteīns tika attīrīts, kā aprakstīts iepriekš (50).
HCoV-229E nsp12-His6 paš-NMPilācijas tests tika veikts, kā aprakstīts EAV nsp9 (16).Īsāk sakot, nsp12-His6 (0,5 µM) satur 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazīnsulfonskābes (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolu (DTT), 6 mM MnCl2, buferi, 25 µM. norādītais NTP un 0,17 µM sakrita ar [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C temperatūrā 30 minūtes.Visos citos (standarta) NMPilācijas testos ar nsp12 mediētu nsp9 NMPilāciju reakcijas apstākļi tiek pielāgoti šādi: nsp12-His6 (0,05 µM) un nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8) klātbūtnē. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM norādīts NTP un 0,17 µM atbilst [α32-P]NTP.Pēc 10 minūšu inkubācijas 30 °C temperatūrā reakcijas paraugs tika sajaukts ar SDS-PAGE parauga buferšķīdumu: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometāna HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerīna un 0,005% bromfenola. zils.Olbaltumvielu denaturēja, karsējot 90 ° C temperatūrā 5 minūtes, un atdalīja ar 12% SDS-PAGE.Gelu fiksē un iekrāso ar Coomassie Brilliant Blue šķīdumu (40% metanola, 10% etiķskābes, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), atkrāso un 20 stundas pakļauj fosforescējošam attēlveidošanas ekrānam (lai noteiktu nsp12 no NMPilācijas). vai (maksimums) 2 stundas (lai novērtētu nsp9 NMPilāciju).Ekrāna skenēšanai tika izmantots Typhoon 9200 attēlveidotājs (GE Healthcare), bet signāla intensitātes analīzei tika izmantots ImageJ.
MS analīzei NMPilācijas analīzē tika izmantots 1 µM nsp12-His6 un 10 µM nsp9 (bez heksahistidīna marķējuma) (SI pielikums, S1 tabula), un tika izmantota palielināta 500 µM UTP un GTP koncentrācija.Atkarībā no to koncentrācijas un paredzamās olbaltumvielu kvalitātes Waters ACQUITY H klases HPLC sistēma, kas aprīkota ar MassPrep kolonnu (Waters), tika izmantota, lai tiešsaistē atsāļotu no 1 līdz 10 µL buferētu olbaltumvielu šķīdumu.Atsāļotais proteīns tiek eluēts Synapt G2Si masas spektrometra (Waters) elektrosmidzināšanas jonu avotā caur šādu bufera A (ūdens/0,05% skudrskābe) un bufera B (acetonitrils/0,045% skudrskābe) gradientu, un kolonnas temperatūra ir 60 °C un plūsmas ātrums 0,1 ml/min: izokrātiska eluēšana ar 5% A 2 minūtes, pēc tam lineārs gradients līdz 95% B 8 minūšu laikā un 95% B saglabāšana vēl 4 minūtes.
Tiek atklāti pozitīvi joni ar masu diapazonu no 500 līdz 5000 m/z.Glu-fibrinopeptīds B tiek mērīts ik pēc 45 sekundēm automātiskai masas novirzes korekcijai.Izmantojiet MassLynx instrumenta programmatūru ar MaxEnt1 paplašinājumu, lai dekonvolētu vidējo spektru pēc bāzes līnijas un izlīdzināšanas atskaitīšanas.
UMPilētais HCoV-229E nsp9 tika sagremots, pievienojot sekvencēšanas pakāpes modificētu tripsīnu (Serva), un inkubēja nakti 37 ° C temperatūrā.Peptīdu atsāļošanai un koncentrēšanai tika izmantota Chromabond C18WP centrifugēšanas kolonna (daļas numurs 730522; Macherey-Nagel).Visbeidzot, peptīds tika izšķīdināts 25 µl ūdens, kas satur 5% acetonitrila un 0, 1% skudrskābes.
Paraugus analizēja MS, izmantojot Orbitrap Velos Pro masas spektrometru (Thermo Scientific).Vislabākā nanoâ HPLC sistēma (Dionex), kas aprīkota ar pielāgotu galā piestiprinātu 50 cm?75 μm C18 RP kolonna, kas pildīta ar 2,4 μm magnētiskām lodītēm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Pievienojiet masu spektrometram tiešsaistē, izmantojot Proxeon nanospray avotu;injicējiet 6 µL tripsīna gremošanas šķīduma 300 µm iekšējā diametrā ×??1 cm C18 PepMap pirmskoncentrācijas kolonna (Thermo Scientific).Par šķīdinātāju izmantojot ūdeni/0,05% skudrskābi, paraugs tika automātiski notverts un atsāļots ar plūsmas ātrumu 6 µL/min.
Lai panāktu triptisko peptīdu atdalīšanu ar plūsmas ātrumu 300 nL/min, tika izmantoti šādi ūdens/0,05% skudrskābes (šķīdinātājs A) un 80% acetonitrila/0,045% skudrskābes (šķīdinātājs B) gradienti: 4% B 5 minūtes, pēc tam 30 A lineārs gradients līdz 45% B dažu minūšu laikā un lineārs pieaugums līdz 95% šķīdinātāja B 5 minūšu laikā.Pievienojiet hromatogrāfijas kolonnu ar nerūsējošā tērauda nanoizstarotāju (Proxeon) un izsmidziniet eluentu tieši masas spektrometra sakarsētajā kapilārā, izmantojot 2300 V potenciālu. Ir saistīta aptaujas skenēšana ar izšķirtspēju 60 000 Orbitrap masas analizatorā. ar vismaz trīs datu MS/MS skenēšanu, dinamiski izslēgta uz 30 sekundēm, izmantojot lineāro jonu slazda sadursmes izraisītu disociāciju vai augstākas enerģijas sadursmes disociāciju apvienojumā ar orbitrap noteikšanu. Izšķirtspēja ir 7500.
Izlikšanas laiks: 03.03.2021